La Inmaculada con el padre Fernando de Mata, hoy en la Gemäldegalerie de Berlín, es otro de los grandes cuadros de Roelas (1612-1613). Se trata de un óleo sobre lienzo cuyas medidas son 319,5 x 172,5 cm, que formó parte de un retablo dedicado a la Purísima Concepción en el convento sevillano de la Encarnación, desaparecido en 1810 por la invasión francesa. Frente al retablo se encontraba la tumba del sacerdote jesuita Fernando de Mata, representado en el cuadro.

Esta pintura pretendía no solo justificar un dogma muy controvertido, sino también preservar la memoria de Mata, gran defensor del dogma inmaculista y uno de los clérigos más influyentes de Sevilla, quien, a ojos de sus seguidores, sería elevado a la categoría de beato. Para ello, Roelas, que había participado en una gran procesión en honor a la Inmaculada Concepción en 1615, yuxtapuso el retrato realista de Mata con la aparición sobrenatural de la Inmaculada.

El sacerdote jesuita, vestido con una sencilla túnica gris negruzca, está arrodillado en primer plano. El sombrero y el bastón lo identifican como un piadoso peregrino. En su mano izquierda, sostiene un pequeño libro negro. Delante del clérigo la Virgen flota sobre una luna creciente que se abre hacia arriba. Una corona de nubes con "putti" rodea su cuerpo. El pan de oro aplicado al lienzo, detrás de la Inmaculada, sugiere el infinito resplandor del cielo. Un segundo círculo, formado por apretadas cabezas de "putti", se halla alrededor de su cabeza, que también figura rodeada por trece estrellas. Sobre María dos ángeles flotan sosteniendo la corona de piedras preciosas que alude a su condición de Reina del Cielo: uno de ellos presenta un lirio blanco como símbolo de su pureza, el otro una rama de palma, signo de su triunfo.

La pintura sigue el tipo pictórico típico para este tema, en el que la mujer vestida de sol del Apocalipsis (Ap 12, 1) aparece junto a los símbolos recitados en las letanías, dispuestos en el paisaje y las nubes: el rosal, el espejo, la estrella del mar, las puertas del cielo, la escalera de Jacob y la luna, así como el jardín, el pozo y la Torre de David.

Aunque el manto de la Virgen, que cuelga sobre la luna creciente, casi roza el pulgar de Mata, éste parece incapaz de ver realmente a María. Su mirada la sobrepasa con claridad. La pintura, por lo tanto, refleja una visión interior en la que Roelas plasma la diferencia entre los distintos niveles de realidad a través de diversas maneras: la rigidez de los rasgos y la postura de María, así como su tamaño más pequeño en comparación con Mata, evocan una escultura de madera policromada. En contraste, el sacerdote jesuita, cuyo retrato se basa en el "Libro de descripción de verdaderos retratos de ilustres y memorables varones", escrito por Francisco Pacheco, se presenta aún más realista. La barba meticulosamente dibujada y su piel bronceada contribuyen al efecto de vivacidad, al igual que la posición torcida de sus ojos y el ceño fruncido con aire pensativo. Por todo ello, a diferencia de la representación del donante, María no proviene de la realidad humana; se trata de una aparición sobrenatural, visible solamente al espectador gracias a la habilidad del pintor.