Sobre un gran zócalo de casi tres metros de altura, con friso y cornisa, construido con mármol sanguíneo y compartimentos de jaspe verde de Sierra Nevada, se apoya el retablo mayor. La traza clásica, muy bella, es obra de Juan de Herrera, quien diseñó una de las creaciones más considerables en valor artístico y riqueza entre las que contiene el Monasterio del Escorial. Sus dimensiones son desusadas pero armoniosas, por la admirable distribución de la enorme superficie en cuatro cuerpos horizontales, divididos por columnas empleadas al modo romano.

El retablo está constituido con mármoles rojos y jaspes verdes en lo arquitectónico, empleándose finas variedades de estos últimos y otros brillantes colores para subrayar detalles decorativos. Todas las basas, capiteles y adornos son de bronce dorado a fuego.

Se contrató la obra en el año 1579, encargándose a León y Pompeio Leoni, escultores broncistas de Milán, las 15 estatuas que figuran en el retablo. La obra de mármoles correspondió a Juan Bautista Comane, a quien al fallecer sucedió su hermano Pedro Castello, quien terminó las columnas de jaspe en el año 1594, siendo ya escultor del monarca Felipe II.

El primer cuerpo o zona inferior del retablo es dórico y posee cinco compartimentos: el central lo ocupa el tabernáculo y a los lados dos óleos sobre lienzo de Peregrin Tibaldi, La Adoración de los Pastores y La Adoración de los Magos, así como cuatro esculturas de los Leoni que representan a los Doctores de la Iglesia. El segundo cuerpo es jónico y presenta similar composición, sólo que en este caso las estatuas representan a los Evangelistas y son tres los lienzos: El Martirio de San Lorenzo, obra de Tibaldi, y La Flagelación y Cristo con la Cruz a Cuestas, realizados por Federico Zuccaro.

El tercer cuerpo, de orden corintio, presenta tres compartimentos en los que se hallan alojados tres cuadros de Zuccaro, flanqueados por estatuas de San Andrés y Santiago: Pentecostés, La Resurrección de Jesús y La Asunción de la Virgen. Por último, el cuarto cuerpo, de orden compuesto, muestra una capilla con las imágenes del Crucificado y la Dolorosa y San Juan a sus pies, albergando en sus extremos sendas estatuas de San Pedro y San Pablo, en cuyo pie se lee la firma "Pompeius Leoni (fecit) 1588".